随着全球经济发展的不断加快，石化能源的大量消耗导致环境污染、全球气候逐渐恶化等问题的出现，研究、发现和利用更为清洁、环保的生物质能源无疑具有极其重要的意义(李剑泉等, 2010)。黄连木(Pisticia chinensis)是漆树科(Anacardiaceae)黄连木属(Pistacia L.)植物，为落叶乔木，雌雄异株。果实含油率在35％左右，果肉含油率在50％左右(侯新村等, 2007)。当前人们已将目光转向黄连木种子生产的生物柴油，其碳链长度集中在C17~C19之间，理化性质与普通柴油非常接近，且该植物分布广泛，喜光、耐干旱、盐碱和瘠薄且抗逆性强，是一个优质的生物质能源树种(王涛, 2006)。

物种的遗传多样性是其赖以生存、发展和进化的基础，遗传多样性越丰富，其适应性进化的潜力就越高，适应环境变化的能力也越强。了解物种遗传多样性水平和遗传变异的空间分布格局对于制定科学的基因资源保护策略具有重要意义，也是动植物育种和遗传改良的理论基础。

近年来遗传多样性的研究主要应用各种分子标记技术，如SSR、RAPD和AFLP等。简单重复序列SSR (simple sequence repeat)，也称微卫星DNA (Amos and Rubinstzein, 1996; Debrauwere et al., 1997)标记技术，它具有多态性高、呈共显性、操作简便、稳定可靠、重复性好等优点，在群体遗传多样性的研究之中应用相当广泛(张赤红等, 2008; 张薇等, 2008)。Huq等(2009)对椴树科长蒴黄麻(Corchorus olitorius)的研究表明SSR分子标记对遗传基础狭窄的植物也可以有效的提供较高基因型多态性。张媛媛等(2007)利用61对SSR引物对原产于中国14个省的440份籼稻地方品种进行了分析，并且对各省、经度和纬度间的籼稻地方品种进行了遗传距离的计算和聚类分析，证明籼稻地方品种的亲缘关系与地理位置有着密切的相关性。

目前国内对于黄连木的研究主要集中于人工栽培技术、病虫害防治(秦飞等, 2007)、种子含油量(李晓旭等, 2008)等，关于黄连木遗传多样性方面的研究较少。目前报导的仅见吴志庄(2008)用SSR标记对黄连木进行了初步的研究，且其材料来源仅限于河北、河南和陕西三个省。但黄连木分布范围广泛，主要分布在河北、河南、陕西、四川、贵州、云南、浙江、江苏、山东和安徽等省区(侯新村等, 2010)。为了获得更全面的黄连木遗传多样性信息，本研究对黄连木分布的主要地区进行全面采样，利用微卫星分子标记，开展群体遗传多样性分析及亲缘关系研究，并利用居群间的亲缘关系对黄连木进行种源区划，对黄连木种源的调配、种质资源的保护与利用奠定理论基础。

1结果与分析
1.1不同省份间黄连木居群遗传多样性
所用引物全部具有多态性(图1)，共检查到37个等位基因，其中Ptms-3扩增出的多态位点最多有5个，而Ptms-9、Ptms-10较少，有3个位点。各省份间黄连木有效等位基因数(Ne)在1.225 0~2.362 7，平均为2.745 5；观察杂合度(Ho)在0.122 2~0.318 5，平均为0.185 7，期望杂合度(He)在0.132 3~0.572 7，平均为0.571 4，Nei’s基因多样性指数h=0.570 0 (表1)。

图1 1号引物扩增图谱

表1 黄连木省居群水平的遗传多样度与遗传分化

Nei’s基因多样性指数显示了各居群的遗传变异由高到低依次是河北(Hebei)＞河南(Henan)＞湖南(Hubei)＞山西(Shanxi)＞贵州(Guizhou)＞云南(Yunnan)＞浙江(Zhejiang)＞江苏(Jiangsu)＞四川(Sichuan)＞湖北(Hubei)＞山东(Shandong)＞安徽(Anhui)＞甘肃(Gansu)。此结果与期望杂合度分析的结果基本一致。其中河北居群相对于其他居群具有相对较高的遗传多样性水平(PIC=0.509 2, He=0.572 7, Ne=2.362 7)，甘肃居群遗传多样性水平最低(PIC=0.114 6, He=0.132 3, Ne=1.225 0)。

1.2不同省份黄连木居群关系
遗传距离是研究物种遗传多样性的基础，它反映了所研究居群的系统进化，用以描述居群的遗传结构及居群间的差异。一般认为居群分化时间越短，遗传距离就越小。由表2可见，各省份间黄连木遗传距离变异范围为0.126 3~1.211 4。其中，江苏与山东、山东与甘肃、江苏与安徽的遗传距离最大，分别为1.211 4、1.058 4和1.018 7；安徽与山东、甘肃与贵州、河北与河南的遗传距离最小，分别为0.126 3、0.145 9和0.154 0。

表2 13个不同省份间黄连木居群遗传距离

按省份进行聚类分析(图2)，13个省的黄连木居群可分为两大类，湖南衡阳独自成为第Ⅰ类群，其余省份为第Ⅱ类群，其中第Ⅱ类群又被分成四个单独的小类群，第ⅰ类群是河北涉县，第ⅱ类群包括河南鸡公山、山东泰山、浙江丽水、安徽采石矶和湖北秭归，第ⅲ类群包括云南保山、山西晋城、四川平武、贵州黎平，第ⅳ类群包括江苏无锡和甘肃舟曲。从总体上看，除地理位置相隔较远的山西晋城与云南保山、四川平武和贵州黎平归为第ⅲ类群，江苏无锡与甘肃舟曲归为第ⅳ类群，其余省份基本上按距离远近进行归类，即距离近的省份归为同一类群，而距离远的省份归为不同类群。

图2 基于Nei’s遗传距离绘制的黄连木居群的UPGMA聚类图

1.3不同纬度间黄连木居群关系
从表3可以看出，各纬度间黄连木居群间的遗传距离变异范围为0.235 0~0.091 1，相邻纬度区组间的遗传距离较小，而相隔远的区组间遗传距离较大。其中，4区组与其他区组间的遗传距离最大，变化在0.201 8~0.235 0；1区组和2区组间的遗传距离最小，为0.091 1。聚类分析结果(图3)表明，4个区组分为两大类群，第Ⅰ类群为1区组即25°N~27°N 范围内的个体，第Ⅱ类群是从28°N~37°N范围的个体。

表3 不同纬度间黄连木居群遗传距离

图3 基于Nei’s遗传距离绘制的黄连木不同纬度的UPGMA聚类图

1.4不同经度间黄连木居群关系
7个经度间黄连木居群间的遗传距离变异范围为0.608 3~0.166 9 (表4)，2区组与6区组遗传距离最大，为0.608 3；其次为4区组与6区组、6区组与7区组、4区组与7区组、2区组与4区组、3区组与6区组，分别为0.546 6、0.525 0、0.451 9、0.435 0和0.431 5，1区组和3区组的遗传距离最小，为0.166 9。

表4 不同经度间黄连木居群遗传距离

 7个区组聚类分析结果(图4)表明，第Ⅰ类群为经度较低的1区组，其余为第Ⅱ类群，包括3个小类群，分别是2区组与3区组、4区组与5区组、6区组与7区组。

图4 基于Nei’s遗传距离绘制的黄连木不同经度的UPGMA聚类图

2讨论
2.1黄连木遗传多样性
普遍认为异交、多年生广布种具有较高的遗传多样性(Hamrick and Godt, 1990)，黄连木在华北、华东、中南、西南、华南和西北等25个省区均有分布，并且是雌雄异株植物，严格异交，理论上应具有较高的遗传多样性。本实验应用SSR分子标记技术，对13个省份的黄连木居群进行遗传多样性研究，所得期望杂合度He为0.571 4，Shannon多样性指数I为1.037 0，平均多态信息含量(PIC)为0.545 8，说明黄连木居群的遗传多样性较高，与上述理论相符合。

研究结果表明，黄连木13个居群中Shannon多样性指数(I)、Nei’s多样性指数(h)和平均多态信息含量(PIC) 3项参数均以河北居群最高(I=0.930 3, h=0.569 0, PIC=0.509 2)，甘肃居群最低(I=0.188 5, h=0.127 9, PIC=0.114 6)。黄连木居群整体虽然表现出较高的遗传多样性，但各居群的遗传多样性存在差异。物种的繁育系统、基因流、遗传漂变和自然选择等被认为是影响物种遗传多样性的重要因子(Schaal et al., 1998)，河北和甘肃居群的差异可能与居群的大小、年龄结构和地理环境有关。

2.2黄连木遗传距离
前人做过很多关于遗传距离与地理距离之间有无相关性的研究，张云红等(2010)利用AFLP研究华北地区小丛红景天(Rhodiola dumulosa)，结果显示遗传距离与地理距离间呈显著的正相关(r=0.512 9, p<0.001)。秦永燕等(2010)采用SSR分子标记在研究翅果油树(Elaeagnus mollis)居群间的遗传分化时发现，居群的地理距离与遗传距离之间呈正相关，但未达到显著水平。Williams和Arnold (2001)的研究认为，桦木科Betula occidentalis遗传多样性与纬度的变化存在相关性。但也有研究表明二者之间没有相关性，Hamrick和Godt (1990)的研究表明，居群的地理分布和遗传多样性分布没有直接的相关性，另外王静等(2010)应用ISSR对连香树(Cercidiphyllum japonicum)进行研究、李晓东等(2003)应用RAPD对孑遗植物水杉(Metasequoia glyptostroboides)的研究结果均显示遗传距离与地理距离间不存在显著的相关性。

本文应用SSR技术对黄连木的遗传距离与其地理位置进行研究，发现二者存在密切的相关性。遗传距离在省份、经度和纬度方面基本趋于一致，这说明地理位置相邻的省份、经度和纬度间黄连木居群的遗传关系较近，而地理位置相隔较远的居群间遗传距离较大。但山西晋城与云南保山、四川平武和贵州黎平为同一小类群，江苏无锡与甘肃舟曲归为不同小类群，出现地理距离较远的居群聚到了一起。而按经度和纬度划分的各区组间黄连木的遗传距离很有规律性，均是按地理距离较近的聚为一个类群。这可能是由于按经度和纬度划分的各区组间自然生态环境的具有规律性变化。由于中国地貌复杂,地势高度相差甚大,地势西高东低，随着经度的降低地势逐渐升高；而生长季的平均气温随纬度的升高而逐渐上升。经度和纬度所带来的地势和气温的变化进一步影响着黄连木生长的诸多要素，如日照、降雨、土壤等的规律性变化(玄海燕等, 2006)，从而影响到黄连木的遗传差异。与此相比，省是人为进行的行政区划，生态环境较为复杂，造成各省份间黄连木的遗传关系比经度和纬度间相对缺乏规律性。

2.3黄连木种源区划
种源区的划分是用种及调种的依据。由于黄连木分布广，各种源间又明显存在差异,所以对黄连木进行种源区划是必要的。通常利用种源多点区域试验结果划分种源区，耗用时间、经费和人力巨大(徐化成, 1990, 北京: 中国林业出版社)。传统的种源区划方法，用主成分分析方法、综合生长性状、形态特征、地理气候因子验证相结合的方法进行区划的(王继志等, 2004, 林业科技开发, 3(18): 17-20)。利用表型性状来分析遗传的相似性不能全面、客观的揭示种源的遗传组成。在未进行种源试验或种源试验结果还未获得之前，可利用分子标记直接在DNA水平进行种源聚类，以此作为辅助对种源区初步划分提供参考意见，这样所花时间和费用将大大减少。

以地理变异规律为基础，把不同种源按其遗传相似程度归并种源群，以阻隔基因交流的自然条件为界限划分种源区。聚类分析表明，按经度和纬度划分的各区组间黄连木的遗传距离更具有规律性。所以在种源区划上以不同经度间黄连木居群遗传距离为主，将黄连木初步划分为四个种源区：第1区为云南保山；第2区为四川平武、甘肃舟曲、贵州黎平和湖北秭归；第3区为河南鸡公山、山西晋城、河北涉县和湖南衡南；第4区为安徽采石矶、江苏无锡、浙江丽水和山东泰山。

3材料和方法
3.1试验材料
2008年和2009年分别在甘肃、河北、山西、山东、河南、安徽、江苏、四川、湖北、浙江、贵州、湖南和云南13个省进行样品采集，上述各省的经度范围为99.09°E~120.18°E，纬度范围为25.08°N~36.31°N，采样地点详细信息见表5。采样是在每个居群随机抽取15~22株，每株间保证100 m以上的距离，要求样株生长正常，无明显缺陷，病虫害少。选取各个样树下部的幼嫩叶片作为实验材料，用变色硅胶干燥保存。

表5 供试材料的采集信息

3.2 DNA提取和PCR扩增
使用植物基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)进行DNA的提取。试验采取20 μL反应体系,，成分为MgCl2 1.5 mmol/L，Taq酶1 U，dNTP 200 μmol/L，引物200 nmol/L，DNA模板40 ng；用BIO-RAD Mycycler基因扩增仪扩增，反应程序为94℃预变性3 min；进行45个循环，94℃变性1 min，Tm℃退火(引物具体退火温度见表6) 1 min，72℃延伸2 min；最后延伸10 min。所用的SSR引物序列来源为吴志庄(2008)，由上海生工生物工程技术服务有限公合成，详见表6。

表6 研究中所用SSR引物的相关信息

3.3扩增产物的检查
PCR扩增产物应用6％聚丙烯酰胺凝胶进行检查，恒功率65 W，1 800 V电泳2 h，电泳缓冲液为1×TBE，硝酸银染色后用数码相机拍照。

3.4数据分析
SSR为共显性的分子标记，所以同一对引物扩增的不同条带代表了同一基因位点上不同的等位基因。在扩增条带读取时，根据迁移率大小依次标记(如: A, B, C)，采用双字母标记黄连木每个位点不同的基因型，纯合基因型用相同字母(如: AA, BB, CC)标记，而杂合基因型则用代表双亲等位基因的字母(如: AB, AC和BC)标记。以此基因型标记结果建立数据矩阵，利用Pop Gene (version1.31)进行遗传多样性分析。

用以下几种遗传多样性参数对黄连木总体和居群遗传多样性水平进行评价：(1)有效等位基因数(Ne)；(2)观察杂合度(Ho)；(3)期望杂合度(He)；(4)Nei’s基因多样性(h)；(5)基因分化系数(FST)；(6)Shannon多样性指数(I)；(7)基因流(Nm)。将试验材料按省份、经度和纬度进行划分，采用NTsys和PopGene分析软件计算各省份、各经度和纬度区组间的黄连木居群进行的遗传距离，并进行聚类分析。

致谢
本课题承蒙十一五国家科技支撑计划项目“生物质资源高效培育技术研究”(2006BAD07A04)基金资助，特致谢意。

作者贡献
该研究的实验和文章的写作部分由郝丽娟独自完成，但林善枝、谢磊、董树斌和张志翔，对实验从立题、数据分析、实验中出现难题的解决、到文章的修改都给予了很大的帮助。

参考文献
Amos W., and Rubinstzein D.C., 1996, Microsatellites are subject to directional evolution, Nature Genetics, 12(1): 13-14

Debrauwere H., Gendrel C.G., Lechat S., and Dutreix M., 1997, Differences and similarities between various tandem repeat sequences: Minisatellites and microsatellites, Biochimie, 79(9-10): 577-586

Hamrick J.L., and Godt M.J.W., 1990, Allozyme diversity in plant species, In: Plant Population Genetics, Breeding and Genetics Resourses, Brown A.H.D., Clegg M.T., Kahler A.L., and Weir B.S., (eds.), Sinauer, Sunderland, MA, pp.43-63

Hou X.C., Mu H.X., Yang S.C., Xing Y.Z. and Jing J., 2007, Research progress in woody energy plant Pistacia chinensis, Anhui Nongye Kexue (Journal of Anhui Agricultural Science), 35(12): 3524-3525 (侯新村, 牟洪香, 杨士春, 邢艳贞, 靖静, 2007, 木本能源植物黄连木研究进展, 安徽农业科学, 5(12): 3524-3525)

Hou X.C., Zuo H.T. and Mu H.X., 2010, Geographical distribution of energy plant Pistacia chinensis Bunge in China, Shengwu Huangjing Xuebao (Ecology and Environmental Sciences), 19(5): 1160-1164 (侯新村, 左海涛, 牟洪香, 2010, 能源植物黄连木在我国的地理分布规律, 生态环境学报, 9(5): 1160-1164)

Huq S., Islam M.S., Sajib A.A., Ashraf N., Haque S., and Khan H., 2009, Genetic diversity and relationship in jute (Corchorus spp.) revealed by SSR markers, Bangladesh Journal of Botany, 38(2): 153-161
Li J.Q., Hou J.J. and Li Z.Y., 2010, Exploitation strengths and development opportunities of forestry biotransformation energy source in China, Linye Keji (Forestry Science & Technology), 35(1): 52-58 (李剑泉, 侯建筠, 李智勇, 2010, 中国林业生物能源开发优势与发展机遇, 林业科技, 35(1): 52-58)

Li X.X., Li H.L., Lin S.Z., Hou B.N., and Zhang Z.X., 2008, Comparative analysis on 100-seed weight and oil content of Pistacia chinensis seed from different provenances, Xiandai Nongye Kexue (Modern Agricultural Sciences), 15(6): 11-13 (李晓旭, 栗宏林, 林善枝, 侯丙娜, 张志翔, 2008, 不同种源黄连木种子百粒重及含油量的比较分析, 现代农业科学, 15(6): 11-13)

Li X.D., Huang H.W., and Li J.Q., 2003, Genetic diversity of the relict plant Metasequoia glyptostroboides, Shengwu Duoyangxing (Biodiversity Science), 11(2): 100-108 (李晓东, 黄宏文, 李建强, 2003, 孑遗植物水杉的遗传多样性研究, 生物多样性, 11(2): 100-108)

Qin F., Guo T.B., Liu Z.G. and Song M.H., Literature review of researches on Pistacia chinensis Bunge, 2007, Jingjilin Yanjiu (Nonwood Forest Research), 25(4): 90-96 (秦飞, 郭同斌, 刘忠刚, 宋明辉, 2007, 中国黄连木研究综述, 经济林研究, 25(4): 90-96)

Qin Y.Y., Wang Y.L., Zhang Q.D., Bi R.C. and Yan G.Q., 2010, Analysis on the population genetic diversity of an endangered plant (Elaeagnus mollis) by SSR Markers, Wuhan Zhiwuxue Yanjiu (Journal of Wuhan Botanical Research), 28(4): 466-472 (秦永燕, 王祎玲, 张钦弟, 毕润成, 闫桂琴, 2010, 濒危植物翅果油树种群的遗传多样性和遗传分化研究, 武汉植物学研究, 28(4): 466-472)

Schaal B.A., Hayworth D.A., Olsen K.M., Rauscher J.T., and Smith W.A., 1998, Phylogeographic studies in plants: Problems and prospects, Molecular Ecology, 7: 465-474

Wu Z.Z., 2008, Study on individual selection, type classification and community investigation of woody energy plant Pistacia chinensis Bung, Dissertation for Ph.D., Chinese Academy of Forestry, Supervisor: Wang T. (吴志庄, 2008, 木本能源植物黄连木单株选择、类型划分与群落调查研究, 博士学位论文, 中国林业科学研究院, 导师: 王涛)

Wang T., 2006, Eco-energy forest--the future raw material base of biomass fuel oil, Shengwuzhi Huaxue Gongcheng (Biomass Chemical Engineering), 40(z1): 1-6 (王涛, 2006, 生态能源林—未来生物质燃料油原料基地, 生物质化学工程, 40(z1): 1-6)

Wang J., Zhang X.P., Li W.L., Wang L., Wu J.X. and Chen Y.K., 2010, Genetic diversity and genetic variation of populations endangered tree Cercidiphyllum japonicum, Zhiwu Yanjiu (Bulletin of Botanical Research), 30(2): 208-214 (王静, 张小平, 李文良, 王磊, 吴建勋, 陈一锟, 2010, 濒危植物连香树居群的遗传多样性和遗传分化研究, 植物研究, 30(2): 208-214)

Williams J.H., and Arnold M.L., 2001, Sources of genetic structure in the woody perennial Betula occidentalis, International Journal of Plant Sciences, 162(5): 1097-1109

Xuan H.Y., Li S.P., and Liu S.Q., 2006, Analysis of the relations between the precipitation on the one hand and longitude, latitude and altitude above sea level on the other, Gansu Kexue Xuebao (Journal of Gansu Sciences), 18(4): 26-28 (玄海燕, 黎锁平, 刘树群, 2006, 区域降水量与经纬度及海拔关系的分析, 甘肃科学学报, 18(4): 26-28)

Zhang C.H., Zhang J., Zhao H.Y., Zhang Y.X., Li Z. and Michael B., 2008, Study on genetic diversity of Barely from 61 countries using SSR markers, Zhiwu Yichuan Ziyuan Xuebao (Journal of Plant Genetic Resources), 9(1): 15-19 (张赤红, 张京, 赵会英, 张云霞, 李珍, Michael Baum, 2008, 应用SSR标记对61个国家大麦遗传多样性的研究, 植物遗传资源学报, 9(1): 15-19)
Zhang W., Gong J., and Ji K.S., 2008, Genetic diversity for seedling orchard of Masson’s pine, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 6(4): 717-723 (张薇, 龚佳, 季孔庶, 2008, 马尾松实生种子园遗传多样性分析, 分子植物育种, 6(4): 717-723)

Zhang Y.H., Hou Y. and Lou A.R., 2010, Population genetic diversity of Rhodiola dumulosa in Northern China inferred from AFLP makers, Zhiwu Shengtai Xuebao (Chinese Journal of Plant Ecology), 34(9): 1084-1094 (张云红, 侯艳, 娄安如, 2010, 华北地区小丛红景天种群的AFLP遗传多样性, 植物生态学报, 34(9): 1084-1094)

Zhang Y.Y., Cao G.L. and Han L.L., 2007, Analysis of relationships for Indica local rice from different places of China, Zuowu Xuebao (Acta Agronomica Sinica), 33(5): 757-762 (张媛媛, 曹桂兰, 韩龙植, 2007, 中国不同地理来源籼稻地方品种的亲缘关系研究, 作物学报, 33(5): 757-762)